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CIRM Centre International de Ressources Microbiennes

Prestations de service

Identification taxonomique moléculaire des souches de levures au niveau de l'espèce

L'identification moléculaire sera effectuée par :

  • Amplification et séquençage de la région D1/D2 de l'ADN ribosomique 26S
  • Comparaison de la séquence obtenue aux séquences des bases de données. (Kurtman & Robnett 1997, J. Clin. Microbiol. 38, 1216-1223; Kurtman & Robnett 1998, Antonie Van Leeuwenhoek. 73, 331-371).

L'identification moléculaire par séquençage et comparaison de séquence D1/D2 est réalisée dans un délai d'environ 10 jours après réception de la souche. Le résultat des analyses est envoyé par courrier électronique et par la poste.

Caractérisation phénotypique des souches de levures

Les tests suivants seront effectués selon van der Walt & Yarrow (1984, The Yeasts a taxonomic study, N.J.W. Kreger-van Rij ed.) :

  • Fermentation de dix sucres
  • Assimilation de 32 sources de carbone (galerie ID32)
  • Assimilation de huit sources d'azote
  • Croissance sur cycloheximide à 0,01 %
  • Croissance sur glucose 50 %
  • Croissance à quatre températures différentes : 30°C, 35°C, 37°C et 40°C
  • Production d'uréase sur milieu Christensen
  • Dégradation de l'arbutine
  • Dégradation d'amidon (pour certaines espèces)
  • Sporulation

La caractérisation phénotypique est effectuée dans un délai d'environ trois semaines après réception de la souche. Le résultat des analyses est envoyé par courrier électronique et par la poste.

Dépôt confidentiel de sécurité

Les souches sont cryo-conservées. Pour des raisons de sécurité elles sont identifiées au niveau de l'espèce par des méthodes moléculaires avant la mise en collection. La responsabilité de l'origine des souches ainsi que leur provenance est entièrement assumée par le déposant. Une souche déposée restera exclusivement propriété du déposant et ne figurera pas au catalogue. Le dépôt de la souche sera effectif au bout d'un mois. La souche sera fournie sur demande au déposant dans la semaine suivant la demande. L'envoi sera à la charge du déposant (voir contrat de dépôt, cliquer ici ).

Dépôt confidentiel de sécurité associé à une carte d'identité moléculaire

Les souches sont cryo-conservées et une carte d'identité est établie. La responsabilité de l'origine des souches ainsi que leur provenance est entièrement assumée par le déposant. Une souche déposée restera exclusivement propriété du déposant et ne figurera pas au catalogue. Le dépôt de la souche et l'obtention des données seront effectifs au bout de deux mois. La souche sera fournie sur demande au déposant dans la semaine suivant la demande. L'envoi sera à la charge du déposant. La carte d'identité d'une souche comprend :

  • L'identification taxonomique classique
  • L'identification taxonomique moléculaire
  • Le caryotypage éléctrophorétique
  • La RFLP de l'ADN mitochondrial
  • La PCR inter-delta ou toute autre méthode fiable de caractérisation intra-spécifique

Caractérisation des espèces par des méthodes moléculaires

Certaines méthodes peuvent être appliquées à certaines espèces (nous contacter). Le temps mis pour caractériser les souches dépendra du volume de souches et de la méthode appliquée.

  • Typage par PCR inter-LTR (applicable aux espèces dont le génome est entiérement séquencé, voir Sohier et al (2009) Dairy Sci.Technol. 89:569-581 (PDF)
  • RFLP de l'ADN mitochondrial
  • Analyse de la ploïdie par cytométrie en flux comme décrit dans Jacques et al (2010) Eukaryot Cell. 9:449-59 (PDF).

Construction d'hybrides par micromanipulation

Les souches de levure sont mises en culture sur un milieu de sporulation adapté en fonction des espèces étudiées. Les asques sont disséqués à l'aide du micromanipulateur MSM System SERIES 400, Singer. Deux spores, correspondant à chacune des espèces à croiser, sont mises en culture côte à côte afin d'obtenir des cellules recombinées. Les recombinants viables sont analysés sur la base de marqueurs moléculaires pré-définis et spécifiques à chacune des espèces. La confirmation de la ploïdie peut s'effectuer soit par cytométrie de flux soit par l'analyse du caryotype. La stabilité des hybrides est étudiée à l'issu d'un suivi de culture sur 100 générations. Le délai de construction des hybrides dépend du type de projet.

Dénombrement de levures dans des produits agro-alimentaires

Des dilutions d'une suspension des échantillons en eau stérile sont étalées sur boite de Pétri (YPD supplémenté en streptomycine à 200µg/ml) et incubées à 28°C pendant 48h; les colonies résultantes sont dénombrées. Le dénombrement de levures est effectué dans un délai d'environ deux semaines après réception du produit.

Analyse de la viabilité des LSA

Les LSA sont mises en suspension dans de l'eau stérile. Le nombre de cellule est établi par comptage en cellule de Malassez et la viabilité des cellules est mesurée par croissance sur boite de Pétri. L'analyse de la viabilité est effectuée dans un délai d'environ deux semaines après réception des LSA.